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實(shí)驗(yàn)干貨,PCR反應(yīng)常見問題分述
點(diǎn)擊次數(shù):1114 更新時(shí)間:2023-05-15

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù),它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR反應(yīng)常見問題分述如下:

1.假陰性,不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備,②引物的質(zhì)量與特異性,③酶的質(zhì)量, ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
模板:

①模板中含有雜蛋白質(zhì),

②模板中含有Taq酶抑制劑,

③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈,特別是染色體中的組蛋白,

④在提取制備模板時(shí)丟失過多,或吸入酚。

⑤模板核酸變性不徹di。在酶和引物質(zhì)量好時(shí),不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,極有可能是標(biāo)本的消化處理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。
酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時(shí)使用,以分析是否因?yàn)槊傅幕钚詥适Щ虿粔蚨鴮?dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)PCR時(shí)忘了加Taq酶或電泳時(shí)忘了加溴化乙錠。
引物:引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱,是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增,對(duì)策為:

①選定一個(gè)好的引物合成單位。

②引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現(xiàn),而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時(shí)做PCR有可能失敗,應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。

③引物使用過程中應(yīng)高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。

④引物設(shè)計(jì)不合理,如引物長度不夠,引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性,濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。
反應(yīng)體積的改變:通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20μl、30μl、50μl或100μl,應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增,是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定,在做小體積如20μl后,再做大體積時(shí),一定要重新摸索條件,否則容易失敗。
物理原因:溫度對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要。如果變性溫度低,變性時(shí)間短,極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低,可導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率;退火溫度過高,影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì),檢測一下PCR儀或水浴鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。
靶序列變異:如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。

2.假陽性
引物設(shè)計(jì)不合適:選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。
靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染,導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決:

①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣器內(nèi)或?yàn)R出離心管外。

②除了酶及其他不耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及進(jìn)樣槍頭均應(yīng)一次性使用。

③必要時(shí),在加標(biāo)本前,反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,與引物互補(bǔ)后,可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生,可用巢式PCR方法來減輕或消除。

3.出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶
PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,或大或小,或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),其原因:一是引物與靶序列不wan全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次,是酶的質(zhì)和量,往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),酶的量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有:

①必要時(shí),重新設(shè)計(jì)引物。

②減低酶的量或調(diào)換另一來源的酶。

③降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。

④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性,65℃左右退火與延伸,也叫兩步法)。

4.出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶的量過大或酶的質(zhì)量差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有:

①減少酶的量,或調(diào)換另一來源的酶。

②減少dNTP的濃度。

③適當(dāng)降低Mg2+濃 度。

④增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)


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